Гемцитабин оказывает значительное цитотоксическое действие на различные клеточные культуры опухолей мыши и человека. Действие гемцитабина зависит от фазы клеточного цикла, препарат в первую очередь уничтожает клетки, в которых происходит синтез ДНК (S-фаза) и в определенных условиях блокирует переход из G1-фазы в S-фазу клеточного цикла. Цитотоксический эффект гемцитабина in vitro зависит от его концентрации и длительности воздействия.