Метотрексат является антагонистом фолиевой кислоты и относится к цитотоксическим средствам класса антиметаболитов. Он действует во время S-фазы клеточного цикла и конкурентно ингибирует фермент дигидрофолатредуктазу, предотвращая таким образом восстановление дигидрофолата до тетрагидрофолата, необходимого для синтеза ДНК и репликации клеток. Активно пролиферирующие ткани, такие как злокачественные образования, костный мозг, фетальные клетки, слизистая полости рта и кишечника, клетки мочевого пузыря, обычно более чувствительны к метотрексату. Поскольку скорость пролиферации злокачественных тканей быстрее нормы, метотрексат может нарушать их развитие, не причиняя необратимого вреда здоровым тканям.